Заказать пиявки с доставкой
Русская версияEnglish version
Тел: (495) 557 08 99
Тел/Факс: (495) 557 14 99
8:30 - 17:00    Пн - Пт
E-mail: 5570899@mail.ru
Контакты
Стоимость медицинской пиявки 55 рублей за штуку

Профилирование белков секрета слюнных желез медицинской пиявки

 

И.П.Баскова1*, Л.Л.Завалова2, А.В.Басанова1, С.А.Мошковский3, В.Г. Згода3.
Профилирование белков секрета слюнных желез медицинской пиявки.

  1. Биологический факультет МГ им. М.В.Ломоносова, 119899 Москва; факс: (095) 939-1745, электронная почта : Saliva1@yandex.ru
  2. Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, 119997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; факс: (095) 330-6538, электронная почта:leech@humgen.siobc.ras.ru
  3. НИИ биомедицинской химии им. А.Н.Ореховича РАН, 119992 Москва, ул.Погодинская, 10; факс: (095) 245-0857, электронная почта: Vic@IBMH.MSK.SU.

В настоящей работе впервые описано многообразие белков высокомолекулярной фракции (молекулярная масса > 500 Да) секрета слюнных желез медицинской пиявки Hirudo medicinalis с использованием методов протеомного анализа. Более 60 отдельных белковых полос, соответствующих молекулярной массе от 11 до 483 кДа выявлено методом 1D–электрофореза. При параллельном использовании 2D–электрофореза получено более 100 отдельных белковых пятен, различающихся молекулярными массами и изоэлектрическими точками. С помощью системы белковых чипов с использованием хроматографических поверхностей на основе сильного анионообменника и слабого катионообменника в сочетании с детекцией посредством SELDI-масс-спектрометрии (MS) в исследуемой фракции определено 45 индивидуальных соединений с молекулярной массой от 1,964 кДа до 66,5 кДа. Сопоставление данных SELDI-MS с данными баз данных с высокой точностью выявило соответствие с восемью известными белками из медицинской пиявки. Остальные молекулярные массы, детектированные методами протеомного анализа, могут относиться как к модификациям известных белков, так и к неизвестным биологически активным компонентам секрета.

Ключевые слова: медицинская пиявка, секрет слюнных желез, протеомный анализ, 1D-электрофорез, 2D-электрофорез, белковый чип, SELDI-MS.

Секрет слюнных желез (ССЖ) медицинской пиявки Hirudo medicinalis является уникальным средством, сочетающим в себе ряд функций, направленных на жизнеобеспечение этого кровососущего животного. Они проявляются в подавлении защитных функций организма хозяина в месте нанесения ранки, что позволяет животному беспрепятственно насасывать кровь в течение продолжительного времени. Несвертываемость насасываемой пиявкой крови обеспечивается секретом слюнных желез, компоненты которого блокируют тромбоцитарно-сосудистый и плазменный гемостаз хозяина в месте нанесения ранки [1-3]. Секрет слюнных желез участвует в поддержании антикоагулянтного и фибринолитического потенциалов насосанной пиявкой крови в кишечном канале животного, регулируя ее переваривание, и обеспечивает антимикробную защиту животного [4]. Он определяет гуморальный эффект гирудотерапии при лечении различных заболеваний человека постановкой пиявок на определенные участки кожи больного. Изливаемый в ранку секрет слюнных желез воздействует на различные системы организма, непосредственно связанные с системой гемостаза. Однако сведения о входящих в его состав белках весьма ограничены, известна структура лишь нескольких белков пиявочного секрета [5 - 13]. В связи с этим весьма актуальна проблема инвентаризации белков, секретируемых клетками слюнных желез и закодированных в геноме этого животного. Такая информация могла бы быть получена методом протеомики, который позволяет идентифицировать, характеризовать и оценивать количество белков в отдельных клетках на базе высокочувствительных методов разделения и анализа белков [14]. Однако в связи с отсутствием сведений о геноме медицинской пиявки в настоящее время не может быть выполнен полный протеомный анализ секрета слюнных желез Hirudo medicinalis. Поэтому впервые нами сделана попытка с помощью методов протеомного анализа, провести картирование белков высокомолекулярной фракции секрета слюнных желез (молекулярная масса более 500 Да).

Методы исследования

Получение и концентрирование высокомолекулярной фракции секрета слюнных желез пиявки. Секрет слюнных желез получали по ранее предложенному методу [15]от медицинских пиявок Hirudo medicinalis, выращенных на биофабрике ООО «Гируд И.Н.» (г.Балаково Саратовской области) и голодавших не менее 6 месяцев. Секрет фракционировали ультрафильтрацией с помощью Minitan («Millipore», США) с использованием мембраны (500 Да) («Spectra Medical Industries Inc.», СШA). Анализировали высокомолекулярную фракцию, содержавшую белки с молекулярной массой более 500 Да. Концентрация белка этой фракции составляла 0,5 мг на 1мл раствора. Белки концентрировали осаждением метанолом в присутствии хлороформа. К 150 мкл раствора высокомолекулярной фракции секрета (150-500 мкг белка) добавляли 60 мкл метанола, а после центрифугирования еще 150 мкл хлороформа, интенсивно встряхивая. Затем приливали 450 мкл воды и снова интенсивно встряхивали. Отделяли водную фазу центрифугированием, а из интерфазы осаждали белки введением 450 мкл метанола. Осадок высушивали и растворяли в буфере А, содержавшем 9 М мочевину, 4% (масса/объем)-ный CHAPS [3-(3-cholamidopropyl)dimethyl-ammonio-1-propanesulfonate], 0,2% (по объему)-ный тритон Х-100, 100 мМ дитиотреитол. Образец в буфере А подвергали ультразвуковой обработке при 40 пятью импульсами длительностью 1 с на дезинтеграторе Soniprep 150 (Англия); частота импульсов’50 кГц, амплитуда - 30 мкм. После этого образец центрифугировали при 12 000 g в течение 15 мин и анализировали полученный супернанатант.

1D-Электрофорез.

1D-Электрофорез проводили по методу Лэммли [16] с использованием 9-16%-ного градиентного геля с нанесением на его поверхность 25-50 мкг белка и смеси маркерных белков с молекулярной массой 97-14 кДа ( «Amerscham», СШA). . Для всех видов окраски использовали гели толщиной 1,5 мм и площадью 20 х 20 см. Окраску гелей серебром с использованием тиосульфата натрия проводили по стандартному протоколу [17]. Сканирование гелей проводили не денситометре Epson 1600«Epson» (Япония). Анализ гелей и денситометрирование дорожек электрофореза проводили с использованием программы LabWorks 4.0, «UVP», США.

2D-Электрофорез.

Анализировали супернатант после добавления к нему 0,2% (масса/объем)-ного Ampholineтм , рН 3-10 («Amersham», Швеция). 2D-Электрофорез проводили с помощью прибора для изоэлектрофокусирования белков Protean IEF Cell («Bio-Rad», США) и установки для 2D-электрофореза Protеan II xi Cell («Bio-Rad», США).

Разделение в первом направлении проводили изоэлектрофокусированием в стеклянных трубках (Bio-Rad, США) с внутренним диаметром 1,5 мм, наружным диаметром 4 мм и длиной геля 17 см, причем пробы наносили из расчета не более 100 мкг общего белка на 1 трубку. Трубки для изоэлектрофокусирования перед нанесением образца заполняли 4,5% (30% Т, 3% С)-ным стандартным полиакриламидным гелем, содержавшим 8 М мочевину, 4% -ный CHAPS, 0,5% (масса/объем)-ный NP-40, 3,6% (по объему)-ный Ampholineтм , рН 5-8, 1,2% (масса/объем)-ный Ampholineтм , рН 3-10. Изоэлектрофокусирование проводили в течение 1 ч при напряжении 250 В, затем в течение 2 ч при 450 В и далее при 950 В до достижения общей мощности 14 000 кВч. После изоэлектрофокусирования трубки в течение 30 мин выдерживали в 0,125 М Tris-буфере, рН 6,8, содержавшем 6 М мочевину, глицерин (300 г/л) и Ds-Na (20 г/л). 2D-Электрофорез проводили с использованием натрий-трицин-додецилсульфат полиакриламидного геля, приготовленного по протоколу [18].

Использование чип-технологии

Для разделения и характеристики белков высокомолекулярной фракции использовали систему белковых чипов с детекцией путем SELDI-масс-спектрометрии («Ciphergen Biosystems Inc.», США). Применяли два вида чипов: SAX2 с хроматографической поверхностью на основе сильного анионообменника и WCX2 с хроматографической поверхностью на основе слабого катионообменника. Для SAX2 использовали связывающий 20 мМ hepes-буфер, pH 7,0, содержавший 0,1% (по объему)-ный тритон X-100, а для WCX2 – буфер, содержавший 0,1 М ацетат аммония, рН 4,5 и 0,1% (по объему)-ный тритон X-100. Чипы подготавливали следующим образом. При помощи 96-луночного биопроцессора («Ciphergen Biosystems Inc».) каждую лунку чипа дважды (по 5 мин) предобрабатывали 200 мкл соответствующего связывающего буфера. Буфер отбирали, и в каждую лунку вносили по 50 мкл разведенного (1:3) связывающим буфером образца фракции, после чего инкубировали для связывания с поверхностью чипа в течение 30 мин при комнатной температуре, постоянно встряхивая. Образец отбирали и лунки дважды (по 5 мин) промывали 200 мкл соответствующего связывающего буфера. Чипы вынимали из биопроцессора и 5 раз ополаскивали водой для ВЭЖХ («Merck», Германия), после чего высушивали на воздухе.

Для масс-спектрометрической детекции наносили раствор матрицы (2х0,5 мкл), в качестве которого для детекции соединений с молекулярной массой 1-10 кДа использовали 20% (по объему)-ную (от насыщенного раствора) -цианогидроксикоричную кислоту (CHCA) в 50% (по объему)-номa ацетонитриле с 0,5% (по объему)-ной трифторуксусной кислотой (ТФУ), а для соединений с молекулярной массой свыше 10 кДа - насыщенный раствор синапиновой кислоты в 50% (по объему)-ном ацетонитриле с 0,5% (по объему)-ной ТФУ.

Чипы помещали в масс-спектрометр PBS II («Ciphergen Biosystems Inc.»). Масс-спектры соединений с молекулярной массой 1-10 кДа получали при интенсивности лазера 200, чувствительности 8, для соединений массой свыше 10 кДа использовали интенсивность лазера 230, чувствительность 9 (внутренние условные характеристики системы). Спектры докалибровывали при помощи внешних стандартов масс (Peptide and Protein Calibration Kits, «Ciphergen Biosystems Inc.»). Точность определения массы составляла не менее 1%.

Результаты и их обсуждение

1D-электрофорез. Результаты 1D-электрофоретического анализа высокомолекулярной фракции пиявочного секрета при двух нагрузках (25 и 50 мкг) (рис.1) свидетельствуют о множественности белков в области молекулярных масс от 6 до >200 кДа.

Денситометрический анализ электрофореграмм дает представление о молекулярной массе каждого из идентифицированных белков (табл. 1). Он свидетельствует о том, что в составе фракции секрета слюнных желез присутствуют более 60 белков в диапазоне молекулярных масс 11–483 кДа.

2D-электрофорез. Сочетание электрофореза с изоэлектрофокусированием позволяет разделить белковые фракции, представленные на одномерных электрофореграммах, и выявить дополнительные белки с различными изоэлектрическими точками. На рис.2 представлена картина разделения белков высокомолекулярной фракции секрета. Для сравнения на этом рисунке представлен 1D-электрофорез этих же белков.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что основную массу представляют высокомолекулярные (>70 кДа) белки секрета слюнных желез. Белки с молекулярными массами 30 – 45 кДа концентрируются преимущественно в области значений pH 4,5 - 5.0 и 5,5 - 6,5, при рН выше 6,5 распределяются белки с молекулярными массами 35-45 кДа. Белки с молекулярными массами ниже 20 кДа распределяются достаточно равномерно в заданном диапазоне значений рН.

Характеристика белков с использованием системы белковых чипов/SELDI-MS. Результаты профилирования высокомолекулярной фракции секрета на белковых ионообменных чипах представлены на рис. 3 и 4. Из спектров, представленных на рис.3, видно, что на двух используемых поверхностях обнаружено 29 соединений с молекулярными массами 1-10 кДа, четыре из которых совпадают для обеих поверхностей. Для белков с молекулярными массами более 10 кДа (рис.4) обнаружено 24 белка, четыре из которых также совпадают для поверхностей сильного анионообменника и слабого катионообменника. Таким образом, всего на данных чипах выявлено 45 соединений с индивидуальной молекулярной массой от 1,964 до 66,5 кДа (табл. 2).

В табл. 3 представлены молекулярные массы известных белков, выделенных из медицинской пиявки. Сравнение этих данных с полученными результатами масс-спектрометрического определения выявило соответствие как минимум в пределах 1% массы полученных пиков с восемью известными белками из пиявки (табл.3). Остальные детектированные молекулярные массы могут относиться как к модификациям известных белков, так и к неизвестным биологически активным компонентам секрета (табл.3).

Впервые нами показано, что в составе высокомолекулярной фракции секрета слюнных желез медицинской пиявки содержится более 100 белков, среди которых идентифицировано восемь известных белков, обладающих различными функциями. Так, ингибитор триптазы и бделластазин (ингибитор трипсина) в составе пиявочного секрета блокируют соответствующие ферменты, продуцируемые тучными клетками подкожной клетчатки организма хозяина [17, 19] при их активации секретом слюнных желез , снижая тем самым его защитные функции в ответ на повреждение целостности кожного покрова при укусе пиявкой. Гиалуронидаза обеспечивает проникновение секрета через ткани путем разрушения гиалуроновой кислоты - важнейшего компонента межклеточного матрикса [20]. Белки секрета слюнных желез обладают мощным антикоагуляционным потенциалом и блокируют тромбоцитарно-сосудистое и плазменное звенья гемостаза. Так, саратин и калин ингибируют адгезию (прилипание) тромбоцитов к поврежденной поверхности сосудистой стенки [13, 11, 21]. Ингибитор фактора Ха и гирудин - высокоспецифический ингибитор фермента тромбина - блокируют плазменное звено гемостаза [9, 22], дестабилаза-лизоцим обеспечивает антибактериальный статус пиявочного секрета [4]. γ-Глутамилтранспептидаза [23] совместно с дестабилазой-мономеразой пиявочного секрета [15] (точная молекулярная масса которой не определена) участвует в регуляции жидкого состояния крови путем высокоспецифического гидролиза эндо-ε-(γ-Glu)-Lys изопептидных связей в стабилизированном фибрине и D-димере. Этими белками не исчерпывается широкий спектр функций секрета слюнных желез медицинской пиявки. Не исключена вероятность того, что носителями ряда функций пиявочного секрета является консорциум белков, впервые представленный в настоящей работе.

Полученные результаты позволили выделить среди известных белков, получаемых из пиявочных экстрактов, белки, относящиеся непосредственно к секрету слюнных желез, - ингибитор триптазы, бделластазин, гирудин, дестабилаза-лизоцим, гиалуронидаза, калин и γ-глутамилтранспептидаза. Исключение составляют сведения об ингибиторе фактора Ха, который был выделен из пиявочного секрета [9]. Его молекулярная масса, приводимая в литературе [9], относится не к нативному, а к рекомбинантому белку, полученному в результате мутации его гена [9]. Возможно, поэтому среди белков секрета он не был обнаружен. С другой стороны, такие известные белки, выделенные из медицинской пиявки, как бделлин В [24], гирустазин [25], ингибитор карбоксипептидазы [26], эглин b и эглин c [27], могли быть и не обнаружены в секрете слюнных желез из-за своей низкой концентрации.

Таким образом, использование методов протеомного анализа позволило выявить многообразие ранее неизвестных белков высокомолекулярной фракции секрета слюнных желез медицинской пиявки, определение структуры и функций которых станет предметом дальнейших исследований.

Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований № 03-04-48508.

Список литературы

1. Баскова И.П.. Никонов Г.И., Мазуров А.В., Миссельвитц Ф., Лейтин В.Л., Репин В.С., Авдонин П.В., Свитина-Улитина И.В. (1987) Биохимия, 52, 1461- 1467. 
2. Баскова И.П., Халиль С., Никонов Г.И. (1984) Бюл эксперим. биол. и мед., .97, 142-143. 
3. Баскова И.П., Халиль С., Никонов Г.И., Рабинович С.Э., Нартикова В.Ф., Пасхина Т.С. (1989) Биохимия, 53, 1467- 1473. 
4. Zavalova, L.L., Baskova, I.P., Lukyanov, A.V., Sass, A.V., Snezkov, E.V., Akopov, S.B., Artamonova, I.I. Archipova, V.S., Nesmeyanov, V.A., Kozlov, D.G., Benevolensky, S.V., Kiseleva, V.I., Poverenny, and A.M., Sverdlov, E.D.(2000) Biochim. Biophys. Acta, 1478, 69-77. 
5. Stubbs,M.T., Morenweiser,R., Stuzebecher,J., Bauer,M., Bode W., Huber,R., Piechottka,G.P., Matschiner,G., Sommerhoff Ch.P., Fritz,H., and Auerswald,E. (1997) J.Biol.Chem., 272, 19931-19937. 
6. Moser, M., Auerswald E., Mentele, R., Eckerskorn, Ch., Fritz, H., and Fink, E. (1998) 
Eur.J.Biochem., 253, 212-220. 
7. Seemuller,U., Dodt,J., Fink,E., and Fritz,H. (1986), in Proteinase Inhibitors (Barret, A.J., and Salvesen, G., eds) Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 337-359. 
8. Zavalova, L. L., Artamonova, I. I., Berezhnoy, S. N., Tagaev, A. A., Baskova, I. P., Andersen, J, Roepstorffand,.P., and . Egorov, Ts. A. (2003) Biochim.Biophys.Res. Commun., 603, 318-323. 
9. Rigbi,M., Jackson,C.M.,Atamna,H., Gigusin,I., Godlust,A., Zeelon,E., Guy,R., Kook,M.,Levanon,A., Werber, M., and Panet,A. (1985) Thromb. Haemostas.,73, 1306. 
10. Yuki, H., and Fishman, W. (1963) J. Biol. Chem., 238, 1877-1879. 
11. Deckmyn,H., Stassen,M., Vreys,I., van Houtte,E., Sawyer,R., and Vermylen, J.(1995) Blood, 85, 712-719. 
12. Friedrich,T., Kroger,B., Korver, W., Strube,K-H., Mayer,T., and Bialojan,S. (1998) Eur.J.Biochem, 256, 297-302. 
13. Cruz, C.P., Eidt, J., Drouilhet, J., Brown, A.T., Yun Fang Wang, Barnes, C.S., and Moursi, M.M. (2001) J. Vasc. Surg., 34, 724-729. 
14. Говорун В.М., Арчаков А.И. (2002) Биохимия, 657, 1341-1359. 
15. Баскова И.П., Завалова Л.Л., Басанова А.В., Сасс А.В.(2001) Биохимия, 66, 1690-1697. 
16 Laemmli, U.K. (1970) Nature, 227, 680-695. 
17. Schwartz, L.B., (1994) Methods Enzymol., 244, 88-100. 
18. Schagger H., and von Jagrw G. (1987) Anal. Biochem., 166, 368-397. 
19. Reinolds, D.S., Stevens, R.L., Lane, W.S., Carr, M.H. Austen, K.F., and Serafin, W.E. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3230-3234. 
20. Yuki, H., and Fishman ,W. (1963) J.Biol.Chem., 238, 1877-1879. 
21. Monro, R., Powell-Jones, C., and Sawyer R. (1991), Blood Coagul. Fibrinolysis, 2, 79-184. 
22. Markwardt, F. (1994) Thromb. Res. 74, 1-23. 
23. Friedrich, T.,Kroger, B., Strube, K.-H., Meyer, T., and Bialojan, S. (1998) 
Eur. J. Biochem., 256, 297-302. 
24. Blum, H., Beier, H., and Gross, H.J. (1987) Electrophoresis, 8, 93-99. 
25. Fritz, H., Gebhardt, M., Meister,R., and Fink, E. (1971) in Proc. Internat. Con. on Proteinase Inhibitors, (Munich 1970), ( Fritz,H., and Tschesche, H., eds), Walter de Gruyter, Berlin, pp 271-280. 
26. Sollner, Ch., Mentele,R., Eckerskorn,Ch., Fritz, H., and Sommerhoff, Ch. (1994) Eur.J.Biochem., 219, 937-943. 
27. Reverter,D., Vendrell, J., Canals, F., Hotstmann, J., Aviles, F., Fritz, H., and Sommerhoff, Ch. (1998) J.Biol.Chem., 273, 32927-32933

Рисунки и таблицы смотри в оригинале статьи
«Биохимия», том 69, выпуск 7,
стр.945-951, 2004.

Все права защищены © 2005 - 2017